革蘭氏染色液

保質(zhì)期：2-8度一年.

革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，媒染劑碘液進(jìn)入菌體后與結(jié)晶紫結(jié)合，革蘭氏陽性菌對碘與結(jié)晶紫攝取量多且牢固，不易被酒精脫色。革蘭氏陰性菌對碘與結(jié)晶紫攝取量少，不牢固，易被酒精脫色。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。

革蘭氏染色液操作步驟：

1、標(biāo)本處理：
（1）.有菌部位的標(biāo)本，如痰液、糞便、各種拭子、創(chuàng)面等可直接涂片。
（2）.無菌部位的標(biāo)本，如腦脊液、胸水、腹水、膽汁、尿液、關(guān)節(jié)液等，應(yīng)取適量標(biāo)本（zui高可達(dá)5-7ml）,經(jīng)3000rpm 離心10min.，取沉渣涂片染色。

2、涂片制作：菌液涂片時(shí)，用接種環(huán)沾取菌液點(diǎn)在載玻片上，標(biāo)本可直接在玻片上涂布；菌落涂片時(shí)，先取生理鹽水一滴，置玻片上，用接種針挑取菌落在鹽水中涂布。制作的涂片應(yīng)自然干燥，并經(jīng)火焰固定，固定的溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背不燙為準(zhǔn)，否則可能使細(xì)菌形態(tài)改變。將固定后的涂片進(jìn)行染色。

3、染色方法：

革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時(shí)間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能會呈陰性反應(yīng)。

（1）.加上結(jié)晶紫后，染色1分鐘，水洗。

（2）.加上碘液后染色1分鐘，水洗。

（3）.加上95%酒精,搖動玻片,根據(jù)涂片厚度,脫色約30-60秒，水洗,吸去水分。

（4）.加上蕃紅后，染色1分鐘，水洗。

（5）.吸干或在空氣中涼干后，油鏡鏡檢。

4．結(jié)果觀察：紫色為革蘭氏陽性，紅色為革蘭氏陰性。

注意事項(xiàng)：

1．標(biāo)本涂片不能太厚，嚴(yán)格按操作要求進(jìn)行。

2．玻片通過火焰溫度不能太高。

3．若涂片較厚，應(yīng)延長脫色時(shí)間，直至不再出現(xiàn)紫色為止。

4．碘液變透明，則不能使用。

5.水洗時(shí)動作要輕柔,沿載玻片對角線方向用洗瓶沖洗,以免把菌體沖掉。

如果用量少，買現(xiàn)成的比較話算，如果用量大，自己配起來也溶液，就是試劑種類多了點(diǎn)。其配制方法如下：

(1)結(jié)晶紫(crystal violet)液：結(jié)晶紫乙醇飽和液(結(jié)晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸銨水溶液80mL 將兩液混勻置24h后過濾即成。

(2)盧戈(Lugol)氏碘液：碘0.33g，碘化鉀0.66g，蒸餾水100mL。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之*溶解，再加蒸餾水至100mL即成。配成后貯于棕色瓶內(nèi)備用，如變?yōu)辄S色即不能使用。

(3)95%乙醇：用于脫色，脫色后可選用以下(4)或(5)的其中一項(xiàng)復(fù)染即可。

(4)番紅溶液：番紅O(safranine，又稱沙黃O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時(shí)取20mL與80mL蒸餾水混勻即可。